Govedarstvo

01.03.2006 Histološka i histokemijska istraživanja testisa epididimisa izlučenih bikova

Ivanka Majić-Balić, CRSH;
Ante Hraste, Veterinarski fakultet, Zagreb;
Pero Božić, CRSH;

HISTOLOŠKA I HISTOKEMIJSKA ISTRAŽIVANJA TESTISA I EPIDIDIMISA IZLUČENIH BIKOVA

U CRSH drže se rasplodni bikovi različitih pasmina (simentalac, holstein-fries., oberintalac, montafonac, bušak, istarski podolac ) te starosti od 1-9 godina,čija se sperma polučuje, duboko smrzaje i upotrebljava za umjetno osjemenjivanje plotkinja. Dugogodišnjim radom primijećeno je da kakvoća sperme bikova (pokretljivost, koncentracija spermija, volumen.. ) varira što ovisi o brojnim čimbenicima (starost, zdravstveno stanje, godišnje doba, način držanja životinje,hormonalni utjecaji…).

Nakon polučivanja ejakulata vrši se makroskopska pretraga ( volumen, boja, konzistencija, miris ) i mikroskopska ( progresivna pokretljivost, gustoća ) a dobiveni rezultati statistički se obrađuju. Statističkom obradom dobije se uvid da li je bik od kojeg se uzima sperma pogodan za iskorištavanje pri umjetnom osjemenjivanju. No kako sve navedene metode ne daju egzaktne pokazatelje zbivanja in vitro u testisima i epididimisu u našem radu koristili smo i histološke i histokemijske pretrage, naprijed navedenih organa uzetih nakon klanja životinja u klaonici.

Histomorfološka istraživanja epididimisa bikova izvršio je Nicader (1958.) podjelivši epididimis u 6 segmenata Martin i Alen (1964.) te Blackshaw i Samisoni (1967.) istražili su u epitelu epididimisa aktivnost dehidrogenaza (SDH, LDH, NADH, NADPH) i utvrdili jaku aktivnost istraženih enzima u epitelu epididimisa te enzima u epitelu epididimisa te Leydigovim stanicama testisa.

Histoenzimatska istraživanja testisa nerasta i jarca izvršili su Wrobel i Kunchel (1968.), bika Eckerman i Wrobel (1971.), Wrobel ( 1972) te Bergerson W. i sur. (1994.) također kod bika. Svi navedeni autori utvrdili su da je aktivnost istraženih dehidrogenaza i dijaforaza prisutna u stanicama epitela epididimisa kao i u sjemenim kanalićima testisa.


MATERIJAL I METODE

Naša istraživanja proveli smo na testisima i epididimisima 20 rasplodnih bikova, izlučenih iz rasploda. Bikovi su držani na vezu i isključivo se upotrebljavaju za proizvodnju duboko smrznute sperme.
Podaci o bikovima te razlozi izlučenja prikazani su u Tablicama 1,2,3,

Bikove smo podijelili u tri skupine:

I Bikovi izlučeni zbog loše kakvoće sperme
II Bikovi izlučeni zbog starosti, uzgojnih nedostataka, patoloških promjena na ekstremitetima, neinfekcioznih i infekcioznih bolesti,
III Kontrola – bikovi sa zadovoljavajućom kakvoćom sperme izlučeni zbog nemogućnosti predvođenja životinja na skok ( puknuće planuma –nasolabiale uzrokovano nosnom alkom).

U sve tri skupine kakvoća sperme je istražena makroskopski ( volumen, boja , konzistencija, miris ), mikroskopski u nativnom preparatu ( pokretljivost, gustoća )te progresivna pokretljivost nakon dubokog smrzavanja.

Od navedenih bikova uzeli smo testise te zamotali u foliju, označili i smrznuli na -18C . Uzorci materijala dopremljeni su u prenosivom hladnjaku u laboratorij zavoda za anatomiju, histologiju i embriologiju Veterinarskog fakulteta u Zagrebu.

Nakon dopreme u laboratorij uzeti su uzorci testisa i epididimisa čiji je jedan dio fiksiran u 10% formalinu, uklopljen u parafin, izrezan na mikrotomu u 8-10 mikrona debele rezove koji su i obojeni hemalaunom i eozinom po Mayeru ( Romeis 1968 ). .Tako fiksirani i obojeni rezovi upotrebljeni su za prikaz aktivnosti dehidrogenaza jantarne i mliječne kis. ( Hess i sur. 1958.) te dijaforaza ( NADH, NADPH ). Scarpeli i sur.1958.

REZULTATI

U testisima bikova iz I skupine ( izlučenih zbog nezadovoljavajuće kakvoće sperme ) bojenjem hemalaunom i eozinom zapaža se histološka građa testisa, no u savijenim sjemenim kanalićima ( tubuli seminiferi convoluti ) vidljivo je da je proces spermatogeneze slab i nejednolik.Naime u pojedinim savijenim kanalićima spermatogonije I i II reda te spermatide nisu jasno izražene , dok je u testisima bikova iz II i III skupine unutar zavijenih sjemenih kanalića spermatogeneza uredna što znači da se mogu zapaziti svi njezini stadiji.

Na histološkim preparatima epididimisa obojenih hemalaunom i eozinom bikova I skupine vidljivo je da je u lumenu koncentracija spermija rijetka, dok je u bikova iz II i III skupine lumen ispunjen obilnim nakupinama spermija.

U skupini bikova koji su izlučeni zbog nezadovoljavajuće kakvoće sperme vidljivo je da je veliki broj odbačenih ejakulata , da pokretljivost spermija u nativnom ejakulatu ne zadovoljava , te je pokretljivost poslije DS ispod 50 %.Na osnovi tih podataka može se reći da kakvoća sperme tih bikova ne zadovoljava pa ih se zbog toga mora izlučiti iz rasploda.

U preparatima testisa obojenim hemalaunom i eozinom zapaža se da je u zavijenim sjemenim kanalićima razvoj spermatogeneze slab i nejednolik.Tako se uz bazalnu membranu u savijenim kanalićima zapaža po 1 ili 2 reda spermatogonija, a u pojedinim kanalićima spermatogonije I i II reda i spermatide nisu jasno izražene.
Aktivnosti GPDH, GDH, SDH, u spermatogonijama bikova iz te skupine bila je slaba.

Nasuprot tome aktivnost dijaforaza je u spermatogonijama i spermatocitama I reda vrlo jaka, a nešto slabija u spermatocitama II reda i spermatidama.Promatrajući preparate epididimisa te skupine obojene hemalaunom i eozinom zapaža se da je lumen ispunjen s razmjerno malim brojem nakupina spermija, što je u skladu s navedenim zapažanjima o slabijoj spermatogenezi, a u vezi s tim i slabijoj kakvoći sperme.Aktivnost dehidrogenaza je slaba do umjerena u bazalnoj membrani , a umjerena u epitelnim stanicama, što vrijedi i za nakupine spermija unutar lumena.

Dijaforaze pokazuju vrlo jaku aktivnost u bazalnoj membrani i epitelnim stanicama, a jaku u sprmijima unutar lumena.

II i III skupina obuhvaća bikove koji su u Centar dovedeni kao zdravi rasplodnjaci ali su , zbog patoloških promjena na papcima ili starosti izlučeni iz rasploda.Prema tome njihova kakvoća sperme zadovoljava , što je vidljivo iz odnosa polučenih i odbačenih ejakulata, gustoće spermija u ejakulatu te pokretljivost u nativnom ejakulatu i poslije dubokog smrzavanja.U preparatima obojenim hemalaunom i eozinom opaža se da su spermatogonije poredane u jedan ili dva reda uz bazalnu membranu , a prema lumenu dolazi izrazito široka zona spermatocita I i II reda te spermatida neposredno uz lumen.

Aktivnost oksidativnih enzima ( GPDH, LDH, SDH,) i dijaforaza NADH i NADPH postoji u svim stanicama spermatogeneze bikova tako je u zoni spermatogonija i primarnih spermatocita aktivnost je umjerena dok je u sekundarnim spermatocitama i spermatidama slabija , a u stanicama intersticija je izrazito slaba aktivnost.Dijaforaze pokazuju vrlo jaku aktivnost u zoni spermatogonija dok je široka zona primarnih i sekundarnih spermatocita te spermatida umjerenog intenziteta a u intersticijskim stanicama je vrlo gusto prisustvo formazanskih zrnaca.

Bojenje hemalaunom i eozinom epididimisa II i III skupine pokazuje dvoredni visokoprizmatični epitel sa stereocilijama a unutar lumena vide se obilne nakupine spermija na kojima se jasno zapažaju glava i rep.Dehidrogenaze pokazuju umjerenu aktivnost u epitelu a slabu u bazalnoj membrani i nakupinama spermija.Dijaforaze pokazuju vrlo jaku aktivnost u epitelnim stanicama i nakupinama spermija , a u bazalnonj membrani umjereno prisustvo enzima.

RASPRAVA

Mikroskopskim pregledom ejakulata istraženih skupina bikova ustvrdili smo da postoje razlike u kakvoći, broju i pokretljivosti spermija .

U skupini bikova (skupina III) koju možemo smatrati kontrolnom u kojoj su bikovi izlučeni zbog nezadovoljavajućeg eksterijera ili puknuća nosnog zrcala, vidljivo je da je razmjerno malo odbačenih ejakulata te da gustoća sperme i njezina pokretljivost poslije dubokog smrzavanja ( DS ) je dobra.Ti se podaci podudaraju s navodima Ricea i Andrewsa, cit.Brizneja ( 1991) prema kojima je kod zdravog bika prosječna količina ejakulata 3,5 ml i gustoća 800 milijuna u 1 mililitru, te otprilike 30 milijardi spermija u ejakulatu.

Naša histomorfološka istraživanja testisa i epididimisa obojenih hemalaunom i eozinom bikova iz te skupine pokazuju da je u zavijenim sjemenim kanalićima proces spermatogeneze potpuno razvijen, što znači da se mogu zapaziti svi razvojni stadiji.U preparatima epididimisa vidljivo je da je epitel dobro izražen, a lumen ispunjen mnoštvom spermija s dobro izraženim glavama i repićima, što potvrđuje navedeni podatak o dobroj spermatogenezi.

U testisima bikova iz I skupine ( izlučenih zbog nezadovoljavajuće kakvoće sperme ) bojenjem hemalaunom i eozinom zapaža se histološka građa testisa, no u savijenim sjemenim kanalićima ( tubuli seminiferi convoluti ) vidljivo je da je proces spermatogeneze slab i nejednolik.Naime u pojedinim savijenim kanalićima spermatogonije I i II reda te spermatide nisu jasno izražene , dok je u testisima bikova iz II i III skupine unutar zavijenih sjemenih kanalića spermatogeneza uredna što znači da se mogu zapaziti svi njezini stadiji.

Na histološkim preparatima epididimisa obojenih hemalaunom i eozinom bikova I skupine vidljivo je da je u lumenu koncentracija spermija rijetka, dok je u lumenu bikova iz II i III skupine lumen ispunjen obilnim nakupinama spermija.

U testisima bikova iz I skupine ( izlučenih zbog nezadovoljavajuće kakvoće sperme ) bojenjem hemalaunom i eozinom zapaža se histološka građa testisa, no u savijenim sjemenim kanalićima ( tubuli seminiferi convoluti ) vidljivo je da je proces spermatogeneze slab i nejednolik.Naime u pojedinim savijenim kanalićima spermatogonije I i II reda te spermatide nisu jasno izražene , dok je u testisima bikova iz II i III skupine unutar zavijenih sjemenih kanalića spermatogeneza uredna što znači da se mogu zapaziti svi njezini stadiji.

Na histološkim preparatima epididimisa obojenih hemalaunom i eozinom bikova I skupine vidljivo je da je u lumenu koncentracija spermija rijetka, dok je u lumenu bikova iz II i III skupine lumen ispunjen obilnim nakupinama spermija.

U skupini bikova koji su izlučeni zbog nezadovoljavajuće kakvoće sperme (tablica 5) vidljivo je da je veliki broj odbačenih ejakulata , da pokretljivost spermija u nativnom ejakulatu ne zadovoljava ( ispod 70 % ) , gustoća ispod 800 milijuna u mililitru sperme, a pokretljivost poslije DS je manja od 50%.Na osnovu tih podataka može se reći da kakvoća sperme tih bikova ne zadovoljava pa ih se moralo izlučiti iz rasploda.

U preparatima testisa obojenim hemalaunom i eozinom zapaža se da je u zavijenim sjemenim kanalićima razvoj spermatogeneze nejednolik i slab.Tako se uz bazalnu membranu u savijenim kanalićima zapaža jedan ili dva reda spermatogonija , a u pojedinim kanalićima spermatogonije I i II reda i spermatide nisu jasno izražene.To potvrđuje naprijed navedenu tvrdnju , dobivenu na temelju mikroskopskog pregleda sperme o njezinoj slabijoj kakvoći.Aktivnost GPDH, GDH, SDH u spermatogonijama bikova iz te skupine bila je slaba .Nasuprot tome, aktivnost dijaforaza je u spermatogonijama i spermatocitama I reda vrlo jaka, a nešto slabija u spermatocitama II reda i spermatidama. U preparatima epididimisa ove skupine obojenih hemalaunom i eozinom zapaža se da je lumen ispunjen s razmjerno malim brojem nakupina spermija, što je u skladu s navedenim zapažanjima o slabijoj spermatogenezi, a u vezi s tim i slabijoj kakvoći sperme.Aktivnost dehidrogenaza je slaba do umjerena u bazalnoj membrani a umjerena u epitelnim stanicama, što vrijedi i za nakupine spermija unutar lumena.Dijaforaze pokazuju vrlo jaku aktivnost u bazalnoj membrani i epitelnim stanicama, a jaku u spermijima unutar lumena.Takvi nalazi o histokemijskoj aktivnosti unutar kanalića testisa i epididimisa ne razlikuju se bitno od danog opisa za bikove kontrolne skupine.

Treća skupina bikova obuhvaća bikove koji su u Centar dovedeni kao zdravi rasplodnjaci ali su, zbog patoloških promjena na papcima,ili starosti izlučeni iz rasploda.Prema tome kakvoća njihove sperme zadovoljava ( Tablica 6), što je vidljivo iz odnosa polučenih i odbačenih ejakulata, gustoće spermija u ejakulatu te pokretljivosti u nativnom ejakulatu i poslije dubokog smrzavanja.To su potvrdila i naša histomorfološka istraživanja testisa i epididimisa u preparatima obojenim hemalaunom i eozinom , u kojima se opaža da su spermatogonije poredane u jedan ili dva reda uz bazalnu membranu, a prema lumenu dolazi izrazito široka zona spermatocita I i II reda te spermatida neposredno uz lumen.

Histomorfološki i histoenzimski nalazi u epididimisu bikova iz te skupine potpuno odgovaraju opisu nalaza kontrolne skupine.
U svih istraženih skupina unutar kanalića epididimisa pojava PAS pozitivnih tvari bila je slaba.


ZAKLJUČCI

1. Bikovi iz I skupine imaju najviše odbačenih ejakulata, najslabiju pokretljivost, nezadovoljavajuću gustoću te slabu pokretljivost spermija poslije dubokog smrzavanja.
2. Histomorfološka istraživanja su pokazala da je spermatogeneza slaba što je vidljivo jer nisu jasno izraženi pojedini stadiji spermatogeneze a lumen epididimisa ispunjen je razmjerno malim brojem spermija.
3. Aktivnosti GPDH , GDH i SDH u spermatogonijama bikova I skupine bila je slaba a aktivnost dijaforaza ( NADH i NADPH ) u spermatogonijama i spermatocitima I reda vrlo jaka, a nešto slabija u spermatocitima II reda i spermatidama.
4. Kakvoća sperme prema makroskopskoj i mikroskopskoj pretrazi u II skupini bikova zadovoljava, malo je odbačenih ejakulata, dobra pokretljivost u nativnom ejakulatu , zadovoljavajuća gustoća spermija te dobra pokretljivost spermija poslije dubokog smrzavanja.Rezultati makroskopske i mikroskopske pretrage u II skupini bikova nešto su slabiji od kontrolne skupine ali po svojoj kakvoći zadovoljavaju postojeće standarde.
5. Histomorfološka istraživanja su pokazala da je spermatogeneza dobra u II i III skupini Aktivnost istraženih dehidrogenaza ( GPDH, LDH, SDH ) i dijaforaza ( NADH, NADPH ) ne pokazuje bitne razlike u rasporedu formazanskih zrnaca, a određene manje razlike zapažaju se u jačini aktivnosti.


Uspoređujući makroskopska i mikroskopska istraživanja sperme te histomorfološka i histokemijska istraživanja testisa i epididimisa dobija se sveobuhvatan uvid u spermatogenezu, pa bi bilo preporučljivo poslije svakog izlučivanja životinja iz rasploda provesti histomorfološka i histokemijska istraživanja.


SAŽETAK

Istraživanja su provedena na 20 rasplodnih bikova koji su izlučeni iz rasploda. Životinje su podjeljene u tri skupine:
I bikovi izlučeni zbog loše kakvoće sperme
II bikovi izlučeni zbog starosti, patoloških promjena na ekstremitetima i drugim neinfekcioznim bolestima
III kontrola – bikovi sa zadovoljavajućom kakvoćom sperme izlučeni zbog puknuća nosnog zrcala

U sve tri skupine istražena je makroskopski i mikroskopski kakvoća sperme. Utvrđeno je da kakvoća sperme u prvoj skupini ne zadovoljava, a u drugoj i trećoj je dobra. Nakon klanja životinja uzeti su uzorci testisa i tijela epididimisa, čiji je dio fiksiran u
10% formalinu i uklopljen u parafin, a dio smrznut na – 20 o C i izrezan u kriostatu na –20 oC. Parafinski rezovi debljine 10 mikrona obojeni su hemalaunom i eozinom a u njima je utvrđeno da je spermatogeneza najbolje izražena u bikova druge i treće skupine u kojih je u lumenu epididimisa zapažena i jača koncentracija spermija.U bikova iz prve skupine spermatogeneza je slabija, a količina spermija u lumenu epididimisa manja. Rezovi dobiveni u kriostatu podvrgnuti su postupcima za prikaz slijedećih enzima:
Dehidrogenaza GPDH, LDH, SDH, i dijaforaza NADPH,NADH .
Utvrđeno je da aktivnosti istraženih enzima postoje u stanicama spermatogeneze, bazalnoj membrani , intersticijskim stanicama i epitelu epididimisa te u nakupinama spermija. Aktivnost enzima ne pokazuje bitne razlike u rasporedu formazanskih zrnaca, a određene manje razlike u jačini reakcije vjerojatno su odraz hormonalnih utjecaja.

SUMMARY

The investigation was carried out on 20 breeding bulls, eliminated from propagation. The animals were divided into the following three groups:

I Bulls eliminated because of poor sperm qualiti.
II Bulls eliminated because of age, pathological changes on the extremities and other non infectious diseases.
III Control – bulls with satisfactory sperm quality, eliminated because of a fractured nasal septum.

In all three groups macroscopic sperm quality was examined, it was found that the quality of sperm in the first group was unsatisfactory and in the second and third groups good.After the animals had been slaughtered samples were taken from the testi and body of the epididymis, part of which was fixed in 10 % formalin and immersed in paraffin, and part frozen at – 20 oC and cut/ sectioned in a cryostat at – 20 C.

Paraffin sections, 20 microns thick, were stained with hemalaun and eosin, and it was established that spermatogenesis was expressed in bulls from the second and third groups, in which a stronger concentracion of sperms was observed in the lumen of the epididymis. In bulls from the first group spermatogenesis was poorer and the amount of sperms in the lumen of the epididimys less.
Section obtained in the cryostat were subjected to methods to show the folowing enzymes : dehydrogenase GDPH, LDH, SDH and diaphorase NADPH, NADH and PAS.

Activity was found of the investigated enzymes in the cells of spermatogenesis, basal membrane, interstial cells and epithelium of the epididymis and groups of sperms.

Enzyme activity did not show essential differences in the distribution of formazan grains, and slight differences in the strenght of the reactin were most likely due to hormonal effect.


LITERATURA

1. Bergerson W, Amselgruber W, Sinowatz F, Bergerson M. (1994 )
Morphological evidence of sperm maturation in the ampula ductusdeferentis of the bull; Cell and Tissue Research.275(3), 537-541.

2. Blackshaw Aw, Samisoni Ji. ( 1967 ): Histocemical localisation of some dehydrogenase enzymes in the bull testis and epididymis.J.Dairu Sci. 50, 747-752.

3. Bloom E: Our bedmurelsen af tyresperma specielt med henblick pa anveldelsen ved.Den kunstige saedoverfiung.Kopenhagen, Martensen 1950.

4. Erkmann G, wrobel KH (1971):Histochemische Untersuchungen an den nebenhodensegmenten des Rindes.Anz. 128, 421-426.

5. Goyal, H.O.,C.S.Wiliams (1991):Regional Differences in the Morphology of the Goat Epididymis: A Light Microscopit and Ultrstructural Study.Am.J.Anat.190, 349-369.

6. Hasse, H.,S.Bach.,K.H.Stemmler ., F.Muller ( 1977):Morfologische Sperma untersuchungen bei Bullen unter besonderer Berucksichtigung der Phasekontrast mikroskopie. Mh Vet.Med. 32, 941.

7. Kurohmaru, M.,S. Yamashiro, T.I. Azmi, P.K. Basrur ( 1992 ) : An Ultrastructural Study of the Sertoli Cell in the Water Buffalo ( Bubalus bubalis ) Anat.Histol.Embriol.21, 82-90.

8. Herak M., Melita Herak, B.Premzl, Ivanka Majić ( 1997 ): activity of creatine kinase in the semen plasma and sperms extrakt of bools of different age and quality of ejaculates V internacionalna konferencija o produkciji ovaca i koza , II simpozij o reprodukciji ovaca i koza i II simpozij o reprodukciji domaćih životinja –
Ohrid 02-05 rujna 1997. Makedonija, Zbornik radova str.142.

9. Wrobel, K.-H. (1972): Zur Morphologie der Ductuli efferentes des Bullen.Z.Zellforsch.135, 129-148.
 



Adresa

CRSH d.o.o.
Centar za reprodukciju u stočarstvu Hrvatske
48260 Križevci
Telefon: +385 48 718 700
Fax: +385 48 718 683
Email: [email protected]

>>> Svi kontakti CRSH-a

Usluge i proizvodi

Prodaja
Govedarstvo
Svinjogojstvo
Kozarstvo i ovčarstvo
Laboratoriji

Arhive

Katalozi
Foto albumi
Dokumenti



Na vrh / Go Top